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一文读懂——质谱流式（上篇）
时间: 2025-03-10 11:18:06 | 作者: 环亚体育全站APP
流式细胞术Flow Cytometry是最经典的单细胞分析技术，可以对单细胞中的多个参数进行仔细的检测，从而对样品进行亚群和功能分析。基于荧光的流式细胞技术到现在已发展了50多年，是非常成熟的细胞检测技术，目前被大范围的应用于生物学的各个研究领域，是各大三甲医院里进行单细胞检测的金标准，尤其是白血病的检测。传统流式技术使用荧光基团对细胞内的各个蛋白质进行仔细的检测，所以又被称为荧光流式。然而，由于荧光基团的限制传统流式技术存在很明显的技术瓶颈，一是因为目前可用的荧光基团数量有限，最多一般不超过20个，实验室常用的通常
8个时，实验的panel设计和补偿计算就慢慢的开始变得极其复杂，使得多参数检测成为一项极为费时、复杂的技术性工作，对操作者的要求极高，从而大大限制了它的发展。
进入21世纪后，新的生物学技术层出不穷，研究人员对于造血发生、免疫细胞分化成熟、癌细胞转化、干细胞自我更新和分化等领域的研究不断深入，单细胞异质性的重要性慢慢的变成了共识。要想更清晰地了解细胞内部的多种细胞因子的各种变化，对检测通道数量和信号质量就有了更高的要求。传统流式技术在诸如此类的科研领域中已经力有不逮，迫切地需要一种更高效、易用、更多参数同时检测的流式细胞技术。质谱流式Mass Cytometry将传统流式技术和质谱技术进行组合创新，使用镧系元素的各个同位素作为金属标签（或者质量标签）替代先前的荧光标签，并使用ICP-TOFMS对金属同位素进行高速、全谱、高分辨的定量分析，完全解决了传统流式中存在的荧光串色问题，实现了
50个参数的同时检测。质谱流式凭借飞行时间质谱超高的分辨率可以完全分离各个金属同位素，相邻通道间的重叠
0.3%，因而无需进行计算补偿，大大简化了实验流程。质谱流式凭借其超高的通量、灵敏度以及稳定性等优点，适用于免疫、肿瘤、血液、药物和遗传学等众多研究领域。
0.3%，基本能忽略不计，无需计算补偿。这样不仅使实验流程得到简化，也节约了标本和试剂。
超高的灵敏度，保证低丰度蛋白的检测。质谱流式兼具质谱仪和聚合物-金属螯合技术双buff。众所周知，质谱仪无与伦比的灵敏度是其能成为分析仪器之王的重要的因素之一。理论上，质谱流式可以检测到万分之一的金属标签原子。除此之外，质谱流式使用在聚合物上螯合了1000个左右的金属元素，再与抗体上的巯基结合，相当于将待测蛋白质进行了3个数量级“扩增”，最低可在单细胞内实现几百个稀有蛋白质的检测。
多样化的数据处理方式，实现对样品的深入分析。通道数激增以及质谱流式超快的检测速度使得数据量急剧增大，对数据处理方法提出了更高的要求。目前，各种降维、聚类和可视化方法已被用于从原始数据中提取有用的生物学信息进行可视化显示，常用的分析方法有：SPADE、PCA、viSNE以及Gemstone等。
2001年7月17日，MDS Sciex（以后的AB Sciex以及现在的Sciex）的科学家Dmitry Bandura（物理学家）, Vladimir Baranov（化学家）, Scott Tanner(质谱学家)和Zoe Quinn提交了专利，提出了一种使用过渡元素标记抗体，并利用抗体和待测样品的免疫结合，最终通过ICP质谱或ICP发射光谱进行仔细的检测的方法，由此开启了质谱流式的纪元。请记住前面这三位大神，后面还会提到。无独有偶，第二天（2001年7月18日）清华大学的张新荣教授提交了题为《A novel combination of immunoreaction andICP-MSas a hyphenated technique for the determination of thyroid-stimulating hormone (TSH) in human serum》的文章，提出了一种使用稀土元素铕（Europium，Eu）作为标签的免疫反应和ICP-QMS组合的新颖技术，用于血液中促甲状腺激素（TSH）的检测。事实上，2001年3月23号，张新荣教授就提交了另外一篇文章《Application of the Biological Conjugate between Antibody and Colloid Au Nanoparticles as Analyte to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry》，并于次年1月1日发表，文章中提出使用胶体金纳米颗粒作为免疫检测的标签，同样使用ICPMS作为检测器。张新荣教授也是位非常令人尊敬的科学家，做了非常多开创性的研究工作，不盲目跟风，喜欢另辟蹊径。我猜张老师手底下应该没有特别强的工程团队，所以尽管有不少成果转化的项目但是都xxx，纯属我瞎猜乱说，张老师勿怪。国内的质谱企业能多找张老师聊聊，搞点原创性的科研成果转化。话接上文，更具戏剧性的是，前面提到的专利其实早在2000年12月28日就已通过临时申请的方式来进行了提交，并于2001年7月17日提交了正式申请。根据美国的专利制度，为了抢占优先权日能够最终靠临时申请提交简易的专利文本，但同时需要临时申请后的一年内提交正式申请进行替代，此时正式申请的专利享有临时申请的优先权日，同时临时申请的文本内容也会在正式申请公开时作为优先权文件一并公开。所以理论上来说张新荣教授在质谱流式理论的萌芽期是有重要贡献的，只不过研究院校更追求学术文章，对专利的重视程度远不如商业机构。
当然，此时专利也好，文章也罢，和目前我们正真看到的质谱流式还是有一墙之隔的，还没有提及用于单细胞的检测，不过离成为质谱流式也就是临门一脚的事情。这有一定的历史原因，一方面单细胞检测在当时还不是那么热门，各种免疫检测技术想的都是如何来解决放射免疫检测的弊病；另一方面尽管人们意识到了这个技术对于多参数检测的优势，但是奈何20年前市面上没有几家公司在生产ICP-TOFMS，当然20年后的今天也算不上很多。这并不是因为ICP-TOFMS的技术门槛太高，而是因为ICP-TOFMS基本上没有自己的对口应用，因而缺乏市场驱动。加之由于ICP-QMS（四极杆质谱）引入了碰撞反应池技术（这个技术的发明者还是那位大神Scott Tanner）解决了多原子干扰的问题，很大程度上解决了四极杆分辨率不够的问题，所以定量要求高，分辨率要求不太高的应用使用ICP-QMS就可以很好地满足规定的要求了，性价比比较高。而对于分辨率要求很高的时候，还有各种无机磁质谱，如果是要求有比较高的同位素丰度比，还有多接收的磁质谱。基本上，ICP-TOFMS没有用武之地，当时属于比较小众的质谱仪器。当时大概只有澳大利亚的GBC公司和美国的LECO公司在生产ICP-TOFMS，大多时候也是用于地质分析领域。
2004年10月，前面提到的三位大神以及同样是在MDS Sciex的同事Olga Ornatsky（生物学家）合伙成立了一家叫DVS Sciences公司，公司名字用的就是三人名字的首字母，必须得说外国人的确很喜欢用自己的名字做公司名，跟我们的那些老字号其实很像。Scott Tanner作为团队的老大任CEO/CTO，从老东家Sciex的手里拿到了有关技术的授权后，2005年他们把公司开在了加拿大，开始打磨这台全新的ICP-TOFMS仪器平台（日后的第一代CyTOF）。Scott Tanner是加拿大人，在多伦多的York University拿到物理化学的博士学位后加入MDS Sciex，并一直那里工作了25年。Scott Tanner认为 University of Toronto是一个非常完美的地方，可以助力他们完成CyTOF仪器和试剂的开发。2005年至2011年期间，Scott Tanner先后任职多伦多大学生物工程系和化学系教授。此后，DVS从Genome Canada和Ontario’s Ministry of Research& Innovation等加拿大政府机构拿到了总计1700万美元的资助。2011年，又从Mohr Davidow Ventures, 5AM Ventures以及Roche，Pfizer等商业机构获得了1500万美元的投资。截止到2011年，DVS从外部获得的资金支持再加上7台CyTOF的出售的收益差不多有4000万美元。值得一提的是，在第一代CyTOF定型之前，DVS团队先后经历了3代原型机和8代试剂的开发，能够说是非常的坎坷，技术创业之艰辛可见一斑。
事实上，质谱流式早期的加快速度进行发展离不开一个人，那就是斯坦福大学医学院的Garry Nolan教授，这又是一位全面开花的骨灰级大佬，不仅学术做得好，科研转化还贼成功，是Rigel（NASDQ上市公司）, Nodality（医疗诊断技术开发）, BINA（基因组学计算技术，被Roche收购）, Apprise（测序解决方案，被Roche收购）等公司的创始人，IONpath（另一家单细胞质谱成像技术公司，和质谱流式有比较大的渊源，后面会提到）和Akoya的联合发起人，以及多家公司（包括DVS）的董事和顾问。Garry Nolan教授在免疫学研究领域名声斐然，是传统流式技术的大牛。Scott Tanner带着自己的黑科技找上门后，Garry Nolan教授意识到这是一项至少能改变免疫学研究的革命性技术，随后便基于CyTOF对人类的骨髓细胞进行了研究，在单细胞水平一起进行了34个参数的检测，系统性揭示了造血系统免疫信号的传导机制，对人类造血系统中的细胞分化有了更详细的认识。相关研究成果刊登在Science杂志上，一经发表立刻引发了全球同行的巨大兴趣，至今全世界研究者使用CyTOF发表了不计其数的CNS（Cell、Nature、Science）文章。由此，质谱流式在生物医学领域名声大噪，持续保持一年几十台的装机量，仪器单价也从一开始的60万美元到了80万美元。毕竟，谁都明白掌握核心科技就能快人一步，贵一点怕什么。必须得说，Garry Nolan教授是一个极其合格的KOL，不仅让CyTOF声名远扬，还为CyTOF适配了很多开源的生信算法，制定了各种各样试验流程供后来者参考，同时还建立了CyTOF论文专门解答和讨论用户在使用CyTOF过程中遇到的各种疑难杂症，甚至还组织各细致划分领域的大佬们专门开设了CyTOF的小型课程（油管上有资源），可以说Garry Nolan教授为质谱流式的普及铺好了第三块基石。
2013年5月，DVS推出了第二代质谱流式CyTOF2以及新款MaxPar试剂盒。CyTOF 2采用了全新的底盘设计，能同时检测单细胞中最多达120种生物标记物，每秒最多可检测1000个细胞，改进了离子光学设计从而将灵敏度提高了1倍。5种新款MaxPar试剂盒含有开展高维度实验所需的所有必要试剂，提供最多达17种开箱即用的金属螯合抗体，还可以与最多16种额外抗体同时结合，在单试管中实现多个细胞群体的高分辨率单细胞检测。
2014年1月29日，美国公司Fluidigm（富鲁达）宣布将以约2.075亿美元收购DVS Sciences。此时，质谱流式发展到了第二代——CyTOF 2。此后，Fluidigm又从Perkin Elmer公司手里买断了和质谱流式有关的所有专利，自此Fluidigm公司拥有了完整的专利、技术和团队，开始全力以赴推动质谱流式向前发展。不过，CyTOF在富鲁达手里并没有如一开始想象的那般美好，至少时至今日也还没到实现Scott Tanner设想的一年100台的装机量或者是每年1亿美元的销售额。富鲁达目前的市值还不到3亿美元，最近3年质谱流式年均出售的收益不到7000万美元（包括仪器、试剂和服务），仪器占比~50%。按平均单价70万美元粗略估算，一年的新增装机大约是50台。这对于一个偏高端的单品质谱仪器其实也还算是一个不错的销量，但对于一个NASDQ的上市公司而言实在算不上是成功，而且科研领域如此火爆，基本上没有同种类型的产品产品的竞争。不得不让人深思，到底是哪里不对劲儿呢？是富鲁达的管理层的问题吗？还是质谱流式的市场有限？亦或是传统流式的反围剿太猛？
近些年富鲁达的高层的确频繁换人，今年从Casdin Capital和 Viking Global Investors注入了2.5亿美元的战略融资之后，从丹纳赫等头部生命科学公司引入了大批高管。招商换帅的同时，富鲁达又把公司英文名改了，现在叫Standard BioTools Inc.，这不得不让人联想到我国五行文化中常见的“更名改运”的策略。换了班底，改了名字，又有大笔的现金流进账，且看3年内会不会有什么起色吧。目前质谱流式主要是在科研市场，虽然临床和制药领域已经开展了不少临床试验，但是还没有真正进入临床市场，比较还没有一点一个企业获得任何国家的医疗器械注册证。如果真能打开临床市场的大门，的确是会带来非常大的利润。不过奇怪的是，这么多年过去了始终没听说富鲁达在进行医疗器械的注册，事出反常不应该啊。至于传统流式的反攻，我相信一定是有的。其实关于质谱流式和传统流式的讨论一直都存在，毋庸置疑质谱流式绝对是有优势的，只不过大部分情况下只是在多参数，高分辨方面有比较大的优势，其他不少指标实际上逊色不少的，比如传统流式的样品分析速度10000个细胞/秒，质谱流式通常低于1000个细胞/秒；传统流式的灵敏度和样品利用效率都高于质谱流式；另外传统流式能够直接进行细胞筛选和回收，质谱流式则不能。而且，基于荧光的流式技术也在发展，比如2004年提出的光谱流式也是主打多参数，创新点在于光路系统、光电检测和数据算法上，如今2014年成立的Cytek推出的Aurora光谱流式也能轻松实现5激光40色的多参数检测。而且，其24色的仪器和试剂分别已经拿到了NMPA医疗器械二类和试剂一类注册证，成功迈入了临床市场。2021年7月，Cytek公司成功敲钟NASDQ，市值一度高达25.4亿美元，目前回落到15.8亿美元。2021年，Cytek全年收入1.28亿美元，而今年第一季度净收入同比增长高达44%。
话说当年在Fluidigm之前，DVS其实是找了多个潜在买家的，包括Life Technologies，Agilent和Thermo Fisher等巨头。大概是当时的DVS过于弱小，而安捷伦和赛默飞这种质谱大厂一看，心想你这个质谱也没什么啊，比你这复杂的我都有，何必花钱买呢。巨头没有看在眼里。如今，Life Technologies已经被赛默飞收购，安捷伦以2.5亿美金买了中国的流式公司艾森生物，而赛默飞也推出了自己的Attune NxT流式细胞仪（基于声波聚焦技术，分析速度高达35000个/秒）。
2017年10月4日，富鲁达发布了一款新的产品Hyperion™组织质谱成像系统，同样是使用包含金属同位素标签的抗体试剂对固定的样本或者石蜡包埋以及冰冻组织的切片样品进行染色，然后通过激光烧蚀技术进行微米尺度的采样，并最终通过质谱流式进行仔细的检测，由此能够实现亚细胞水平的组织成像，为组织微环境的研究提供了全新的视野。
关于质谱流式的“好戏”其实还没完，2019年9月，富鲁达一纸诉状起诉一家叫IONpath的勇于探索商业模式的公司，称其2018年发布了侵犯其专利技术的MIBITM（Multiplexed Ion Beam Imaging）高维空间蛋白质组学技术，一样能在亚细胞水平进行40个生物标记物的多重质谱成像。富鲁达称自2019年起IONpath开始向市场积极推广，并顺服和默许富鲁达的用户搭配使用IONpath的MIBI仪器和富鲁达的试剂。IONpath何许人也？还记得我们前面列举过Garry Nolan教授一大堆的创始人头衔吗？没错，Garry Nolan教授是IONpath的联合发起人，而公司的主要创始人也是来自Garry Nolan教授实验室。Garry Nolan教授曾是DVS的科学顾问委员会的主席，DVS被收购之后，仍担任顾问职责直到2016年底。同时，同样来自Garry Nolan实验室的其他IONpath创始人也在富鲁达担任顾问，而且IONpath成立于2014年，是任职顾问不久之后的事情。看来IONpath的确是动了富鲁达的奶酪，据说IONpath的发展速度比DVS早期还要快，第一年的装机量就接近小10台。这恰好给了富鲁达管理层找到了一个业绩不佳的口实，好家伙，原来是你小子在偷偷吸血。作了他！富鲁达来势汹汹，且言之凿凿。其实，老实说从MIBI和Hyperion两者的硬件架构上来看，其实差别还挺大的。尤其是，MIBI的空间分辨率指标其实比Hyperion还高了好多，前者的空间分辨率可到280nm，是真正的亚细胞水平，而后者通常只有1μm。这主要根据前端的采样技术。我们前面提到Hyperion用的激光烧蚀，那主要受限于激光聚焦的束斑尺寸，目前也基本上只能做到1μm这种水平，而MIBI采用的是二次离子质谱技术（SIMS），这也不是一个新鲜玩意儿，属于一个比较高端的配置，是使用聚焦的高能离子束（Primary Ions，叫它一次离子好了）对样品表明上进行轰击，然后解吸和电离出二次待测样品离子（Secondary Ions）的技术。
不过，任何一个时间里也不能坐以待毙，毕竟天无绝人之路，何况手里还有世界上最领先的质谱成像技术。2020年9月24日，IONpath宣布获得了1800万美元的B轮融资，众多的新老投资人中还包括老牌质谱公司Bruker。自从Bruke推出了timsTOF系列新产品之后，在组学领域牢牢站稳了脚跟，现在又在逐步布局空间蛋白质组学了。2021年6月，Bruker还发布了针对单细胞蛋白组学的timsTOF SCP，可在数百个单细胞的分析中得到约 1,500 个蛋白质/细胞的定量分析结果，实现了真实无偏的单细胞蛋白组分析。必须得说，质谱这个已发展了100多年的玩意儿目前看还是没有尽头的，而国内的质谱水平也还只是小学生，我们的视野应该放开一些，多一些合作开拓大市场，小一些争斗莫纠缠在小市场。话说回来，资本的嗅觉是最敏锐的，钱来了生路就来了。
果不其然，2021年1月法院驳回了富鲁达对IONpath的指控，但保留其继续上诉的权利，同时称二者的技术并不完全相同，前者是一个细胞一个细胞的分析，而后者像是打印机一样来回分析，反复扫描。这么说来，专利这种侵权官司远没有几个权利要求读起来那么简单，官司打起来了律师才是最关键的。所以未来如果国内质谱公司遇到和国际巨头打官司的情况，不要气馁和害怕，除了靠好的研发人员夯实技术，也要找个好律师加持。
2022年5月11日，IONpath宣布完成了Corporate Round融资，巨头Thermo Fisher是唯一投资结构，同时这也是IONpath的第4次融资。被第二个质谱巨头加持，说明IONpath的路是走对了，这下妥了。而就上个月，2022年6月10号，Thermo刚宣布了已与TransMIT质谱开发中心合作，共同促进质谱成像技术在空间多组学领域的发展，具体是将前者的Orbitrap质谱和后者的Scanning Microscope Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization(SMALDI) MSI和3D-surface MSI技术进行联用，可用于绘制包括代谢物、多肽、酶解的蛋白质等多种标记物分子的空间分布。由此能够看出，质谱成像技术是巨头们都在积极布局的一个市场。所以不管是Standard BioTools还是IONpath，日后无论能不能经营好，技术肯定是不愁找不到好买家的。
质谱流式的确是个不错的方向，没那么多的巨头挡着，技术路径最简单，未来市场发展的潜力又很明朗，还能彰显大国重器，为国分忧，是再好不过的潜力股了。在笔者看来，质谱流式技术的发展才起步，技术的迭代、细分和升级依然大有可为。未来的领头羊或许不会是Standard BioTools掌握，至少从目前的趋势看不会。国产质谱的崛起需要有一款旗帜产品在全球树立国产质谱的形象，质谱流式目前就具备这样的特质。
